Ab-PROTAC偶联物是将PROTAC抉择性递送到当前人体細胞膜的一款技术。免疫抗体阳性-**偶联物（ADC）都需要将致癌性活性朋友地分享给**人体細胞膜，大数量才能减少毒副效应。ADC还都需要明显增强曲妥珠单抗（Herceptin）或培妥珠单抗（Perjeta）等单克隆免疫抗体阳性的，尽管鉴于ADC一直有的互补性性（诸如被非靶向疗法人体細胞膜摄食），**仅仅只有众多ADC荣获FDA申批。ADC进展要面临的基本挑战性与残留量约束性致癌性（DLT）有关于，即功能主治与脱靶致癌性相互间不易稳定平衡。ADC的另外一只个不足之处是实际上的分享到中的**残留量不怎么，这后果着**分子式须得极具**的人体細胞膜致癌性，这或者会会造成毒副效应。鉴于PROTAC极具离子液体性从而较低残留量便可分解对方血清，所以说PROTAC或者是ADC的人生理想根据。
按照曲妥珠单抗-PROTAC偶联物可能保证PROTAC的进行选取性递送，并在HER2抗体阳性体上皮体细胞系数中取性分解塑料对象蛋白质。偶联物将特情人结合实际HER2/neu蛋白激酶，依据内吞进体上皮体细胞系后被溶酶体化解保持出活性氧PROTAC（见图1A）。主要是因为BRD4是发炎和**症的存在靶标，探究了****体上皮体细胞系模形中使用曲妥珠单抗和PROTAC偶联物保证特情人体上皮体细胞系性质中BRD4分解塑料的价值。
本文**选择BRD4降解剂MZ1的类似物PROTAC 1进行概念验证研究（图1B）。据报道100 nM MZ1处理细胞4小时后便可实现BRD4的完全降解，这种类型的PROTAC由BET的配体JQ1和VHL的配体组成。
**制订了通过叠氮和炔的环加成反应将PROTAC和曲妥珠单抗偶联的策略。利用化合物1的VHL配体部分上的游离羟基来结合叠氮端的PEG生成叠氮功能化的PROTAC，该羟基对于VHL的结合不可或缺，因此结合将PROTAC活性直到被溶酶体水解后才能生成活性的PROTAC。之后还原曲妥珠单抗的二硫键并与化合物13反应生成炔基功能化的曲妥珠单抗并将反应物在pH 8.5缓冲液中孵育过夜使其水解为具有血清稳定性的马来酰胺酸，后通过炔基官能化的曲妥珠单抗和叠氮-PROTAC 2之间的反应获得具有可控载荷和具有血清稳定性的Ab-PROTAC 3偶联物，从而确保了偶联物仅可通过酯基的水解释放PROTAC。Ab-PROTAC 3偶联物的合成由于没有采用铜（I）催化而排除了铜（I）的副作用。LC-MS分析显示了偶联物的成功合成，ELISA证实了抗体结合后活性仍完全保留。此外作者还是发现Ab-PROTAC 3具有稳定性：在37摄氏度pH 7.4的PBS中孵育4小时后仍有98.8％均保持完整结构，在孵育24小时后结构完整的偶联物仍高达83.5％（见图1E）。
基于细胞系中HER2/neu受体和BRD4的表达水平（见图2A、2B）和在测试相同条件下细胞系中游离PROTAC 1降解BRD4的能力（图2C），研究者选择了两种HER2阴性****细胞系（MCF-7和MDA-MB-231）和两种HER2阳性****细胞系（SK-BR-3和BT-474）来检测Ab-PROTAC 3的生物学活性。HER2 +和HER2-表型中，PROTAC 1对BRD4的降解差异性可能与细胞系中BRD4的表达差异有关。每种细胞系均用PBS、抗体（曲妥珠单抗）或阳性对照4（图2E）或不同浓度的Ab-PROTAC 3处理，并将BRD4降解剂4对BRD4的降解量作为阳性对照。认识到Ab-PROTAC 3在生理pH下稳定，作者在无血清培养基中用Ab-PROTAC 3处理细胞4小时或在处理1小时后将偶联物除去再培养23小时。
WB解析（图2D）取决于Ab-PROTAC 3仅选性可化学溶解HER2+癌癌上皮生殖癌神经元膜中的BRD4，而对HER2-癌癌上皮生殖癌神经元膜中的BRD4无作用。用100 nM Ab-PROTAC 3清理癌癌上皮生殖癌神经元膜4 h，仅在HER2+癌癌上皮生殖癌神经元膜系中探究已到BRD4的是可化学溶解（50 nM同时也能探究到BRD4确实不错可化学溶解），而在其它测试英文含量下HER2-癌癌上皮生殖癌神经元膜系均未探究到可化学溶解。与此同时，用Ab-PROTAC 3清理HER2+癌癌上皮生殖癌神经元膜1几小时内左右后排除Ab-PROTAC 3再继续孵育23几小时内左右也探究已到BRD4的确实不错可化学溶解，这取决于偶联物在1几小时内左右的期间已完全到到HER2+癌癌上皮生殖癌神经元膜中并被溶酶体工业制硝酸引发了标准容量的PROTAC 1。因为Ab-PROTAC 3对中缺HER2/neu蛋白激酶外观的癌癌上皮生殖癌神经元膜无法开展HER2/neu介导的内化，如此就没有探究到可化学溶解。需要特别留意，可用曲妥珠单抗清理癌癌上皮生殖癌神经元膜的其它实验室操作下表中未探究到BRD4可化学溶解。等等实验室操作最终证明书了HER2/neu介导的表面抗原-PROTAC偶联物能选性交换PROTAC。
收起来，进这一步探究式Ab-PROTAC 3能不能经由血清酶体诱导型BRD4光吸附，在用到/不用到血清酶体剂硼替佐米（BTZ）的条件下，将癌组织细胞核与PBS、抗体阳性参考4或100 nM Ab-PROTAC 3孵育后将癌组织细胞核裂解，WB凸显了血清酶体剂可拒绝两个HER2+癌组织细胞核系中Ab-PROTAC 3介导的BRD4光吸附（图2F）。
感觉介导的抵抗能力阳性内化已实现多种措施开始了丰富科研，是指放射线标签图片符号、荧光光学高倍显微镜、普鲁士蓝染色上皮神经元核术或上皮神经元核致癌性检测法。在这其中，运用荧光标签图片符号抵抗能力阳性的共精准手机固定光学高倍显微镜是可以对抵抗能力阳性在多种上皮神经元核区室（譬如内体或溶酶体）开始手机固定。前者有科研有关报道运用一种措施确实曲妥珠单抗的内化和上皮神经元核内区室化，认定书HER2/曲妥珠单抗黏结物的内身体内化。顾虑到以上先例，创作者重在实现共精准手机固定光学高倍显微镜科研活上皮神经元核中Ab-PROTAC 3的车辆，以查证内化齐头并进步分折配合物在上皮神经元核内大环境中的症状。对于那些以上科研，运用了荧光标签图片符号的AlexaFluor488-Ab-PROTAC（AF488-3），将HER2 + SK-BR-3上皮神经元核与100 nM AF488-3孵育1个钟头后洗洁上皮神经元核，并在1、4、8和24个钟头的日期影像以科研黏结物的车辆（见图3A）。1 h时在上皮神经元核面上看到AF488-3，而在孵育4 h后AF488-3都已经 部位进去到多种的上皮神经元核屋内，或许是中级证书和次级内体（图3A和3C）。8个钟头后AF488标签图片符号的区室与溶酶体丰富共手机固定（图3A和3C）；在没将配合物洗刷的症状下也看等到了一样的最终。溶酶体助消化Ab-PROTAC 3后须缓解压力分离的生物PROTAC 1，随后进去上皮神经元核核以才会打断BRD4化学吸附。在不同状况下展现**关卡的HER2感觉的MCF-7上皮神经元核尚未摄食AF488-3（图3B），这与以上上皮神经元核的BED4不允许被Ab-PROTAC引发化学吸附相同。
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