AF 488 Acid,AlexaFluor488羧酸的偶联机制及应用
AF488 Acid,即 Alexa Fluor 488羧酸,是Thermo Fisher Scientific公司开发的Alexa Fluor系列荧光染料中的重要成员之一。该染料具有明亮、稳定的绿色荧光,是分子和细胞生物学研究中广泛使用的标记工具。其带有羧酸(-COOH)官能团,为化学修饰与偶联提供了便利,是制作多种荧光探针、标记蛋白质、抗体及其他生物大分子的前体。
Alexa Fluor 488是FITC的代用品,享有比较高的光增强性和荧光硬度,符合长时刻高硬度的荧光三维成像和多色荧光介绍。活化方法
使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)共同活化羧酸基团,生成高活性的NHS酯形式(AF488 NHS Ester),随后与蛋白质、抗体等含氨基的生物大分子偶联。
偶联反应
NHS酯与伯胺基团发生亲核攻击,形成稳定的酰胺键,实现染料与生物分子的共价连接。
反应条件
pH 7.4–8.5的缓冲液中,常温反应30分钟至1小时,避光操作。
蛋白质和抗体标记
利用AF488 NHS Ester标记蛋白质和抗体,用于免疫荧光染色、Western blot、免疫组化和流式细胞术。
核酸标记
与含氨基修饰的寡核苷酸偶联,制备高灵敏度的荧光探针,应用于原位杂交、荧光PCR等。
细胞和组织成像
适合共聚焦显微镜、多色荧光成像,定位细胞内蛋白质、胞器及分子动力学研究。
多色荧光分析
由于光谱特性与其他Alexa Fluor染料互补,常与Alexa Fluor 555、647等染料组合,实现复杂样本的多参数分析。
生物传感器开发
构建基于荧光共振能量转移(FRET)和酶活性检测的传感器。